När Mario anländer till Delfino Island upptäcker han en ö som är nedsmutsad av föroreningar och täckt av graffiti. Utrustad med sin nya flerfunktionspump måste Mario återställa öns glans och upptäcka den verkliga boven. Klättra uppför branta sluttningar, korsa farliga passager och slåss mot alla typer av bossar, inklusive lerspytande Piranha-växter.